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Testbericht oxidativer Stress bei Darmepithelzellen_09.06.2023

Dartsch Scientific GmbH  Auf der Voßhardt 25  D-49419 Wagenfeld Auf der Voßhardt 25 Wassermatrix AG D-49419 Wagenfeld, Germany Blegistrasse 1 Fon: +49 5444 980 1322 Mobil: +49 151 2272 1294 CH- 6343 Rotkreuz Email: info@dartsch-scientific.com Web: www.dartsch-scientific.com

Juni 2023

TESTBERICHT Wirkeffekte des TESLA Oszillators bei oxidativem Stress

Untersuchungen mit kultivierten Darmepithelzellen bei 3 x 20 min Befeldung/Tag

Hintergrund und Fragestellung Das Tesla Experimentier-Set der Firma Wassermatrix AG aus CH-6343 Rotkreuz in der Schweiz wird so beschrieben, dass es über die Handsonde (1) Wasser in einem Glas infor- mieren/strukturieren/energetisieren kann, so dass nach dem Trinken die körpereigenen Energiefelder aktiviert und die Selbstheilungskräfte angesprochen werden und (2) auch direkt das Körperwasser (=etwa 60 % des Körpergewichtes) energetisieren kann. In der vorliegenden Studie wurde mit tierversuchsfreien und aktuellen zellbiologischen Testverfahren untersucht, ob das Tesla Experimentier-Set in der Lage ist, einen möglichen Radikalüberschuss aus der Umwelt bzw. Umgebung zu kompensieren und so einen uner- wünschten oxidativen Stress zu vermindern. Als Zellkulturmodell wurden kultivierte Darmepithelzellen vom Schwein gewählt. Dieses of- fene System steht direkt in Kontakt mit der Umwelt und ist somit der Primärwirkung von Umweltverschmutzung, Nahrungsmittelunverträglichkeiten, Xenobiotika sowie einer Viel- zahl verschiedener chemischer Substanzen ausgesetzt, welche zu einem oxidativen Stress führen können. Dieser wiederum kann die Regenerationsfähigkeit und Integrität der Darmwandbarriere negativ beeinflussen, so dass durch einen „durchlässigen Darm“ (leaky gut) unerwünschte Substanzen durch die Darmwand in den Blutkreislauf gelangen und die systemische Gesundheit und das Wohlbefinden vermindern können.

Verwendete Zellen Die hier vorgestellten Untersuchungen wurden mit IPEC-J2-Zellen (ACC-701; Leibniz Insti- tut, DSMZ, Braunschweig, Deutschland) durchgeführt. Die Zellen wurden routinemäßig in Dulbecco's Modifikation von Eagles Medium (DMEM; 1,0 g/L Glucose) mit 10 % Wachs- tumsgemisch und 0,5 % Gentamycin in einem Begasungsbrutschrank bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 5 % CO2 und 95 % Luft bei nahezu 100 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Zellen wurden routinemäßig als Massenkulturen gezüchtet und regelmäßig zweimal wö- chentlich mit frischem Kulturmedium subkultiviert. Für die Experimente wurden Zellen aus 80 bis 90 % konfluenten Massenkulturen genommen. Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 Laut Vergauwen (2015) sind IPEC-J2-Zellen „intestinale Schweine-Enterozyten, die aus dem Jejunum eines neugeborenen ungesäugten Ferkels isoliert wurden. Die IPEC-J2-Zell- linie ist einzigartig, da sie aus dem Dünndarm stammt und von Natur aus weder transfor- miert noch tumorerzeugend ist. IPEC-J2-Zellen ahmen die menschliche Physiologie bes- ser nach als jede andere Zelllinie nicht-menschlichen Ursprungs.“ Die Zellen wurden ur- sprünglich 1989 von Helen Berschneider an der University of North Carolina isoliert (Ber- schneider 1989). Der Vorteil der IPEC-J2-Zelllinie als in vitro-Modell ergibt sich aus ihrer morphologischen und funktionellen Ähnlichkeit mit intestinalen Epithelzellen in vivo. IPEC-J2-Zellen haben Mikrovilli auf ihrer apikalen Seite und Tight Junctions, die als Barriere wirken und die epi- theliale Funktionalität widerspiegeln (Schierack et al. 2006). Vergauwen H (2015). The IPEC-J2 cell line. In: Verhoeckx K. et al. (eds) The Impact of Food Bio- actives on Health. Springer, Cham, pp. 125-134. https://doi.org/10.1007/978-3-319-16104-4_12. Berschneider HM (1989). Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl. Gastroenterology 96:A41. Schierack P, Nordhoff M, Pollmann M, Weyrauch KD, Amasheh S, Lodemann U, Jores J, Tachu B, Kleta S, Blikslager A, Tedin K, Wieler LH (2006). Characterization of a porcine intestinal epithelial cell line for in vitro studies of microbial pathogenesis in swine. Histochem Cell Biol 125:293–305. doi: 10.1007/s00418-005-0067-z

Versuchsaufbau Für die Befeldung wurde die Handsonde außerhalb des Brutschrankes senkrecht mit dem grünen Antennenstab nach unten in ein Tischstativ eingespannt. Die zu behandelnden Zellkulturen wurden direkt unter die Spitze des Antennenstabs plaziert. Die entsprechen- den Kontrollen befanden sich für die gleiche Zeit in einem anderen Raum mindestens 5 m entfernt hinter mehreren Wänden. Im Vergleich zu den Experimenten aus 2022 (Testbe- richt vom 23. November 2022) erfolgte jetzt die Exposition bei Raumtemperatur innerhalb von 24 Stunden für 3 x 20 Minuten in mehrstündigem Abstand. Bei Experimenten mit einer Vorinkubation der Zellen wurde an jedem Tag für 3 x 20 Minuten befeldet.

Durchgeführte Versuche Grundsätzlich wurde für die Untersuchungen als standardisierter oxidativer Stress in der Umgebung der Zellen Wasserstoffperoxid zur Bereitstellung von reaktiven Sauerstoff- spezies (ROS) im Konzentrationsbereich zwischen 0,25 und 2 mM im Kulturmedium ver- wendet. Der Konzentrationsbereich hing vom jeweiligen Versuch und dem experimentellen Design ab. Als entsprechende Kontrollen dienten parallel angesetzte Zellkulturen ohne Be- feldung. Es wurden die folgenden Tests in Form von mehreren Replikaten pro Wasser- stoffperoxid-Konzentration durchgeführt: 1 Überlebensfähigkeit der Darmepithelzellen innerhalb von 24 Stunden bei Einwirkung von exogenem oxidativen Stress mit und ohne Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 2 Zellregeneration bei der gleichzeitigen Einwirkung von exogenem oxidativen Stress mit und ohne Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators 3 Aufbau der Integrität der Darmwandbarriere nach mehrtägiger Befeldung für 3 x 20 Mi- nuten pro Tag mit der Handsonde des TESLA Oszillators. 4 Integrität der Darmwandbarriere nach Einwirkung von exogenem oxidativen Stress mit und ohne weitere Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators

Ergebnisse 1 Die Auswertung zeigte, dass bei Wasserstoffperoxid-Konzentrationen größer 1 mM die Überlebensfähigkeit der Zellen stets unter 7 % lag. Das galt auch für die befeldeten Zellen. Ganz anders sah es bei niedrigeren Konzentrationen kleiner 1 mM aus. In die- sem Konzentrationsbereich kam es zu keinerlei Reduktion der Überlebensfähigkeit der Zellen. Genau in diesem engen Konzentrationsfenster, nämlich bei 1 mM betrug die Überlebensfähigkeit der unbefeldeten Kontrollzellen 42,8 ± 3,0 %. Die Überlebens- fähigkeit der mit dem Tesla Experimentierset befeldeten Zellen war dagegen erheblich höher und betrug 60,4 ± 4,4 % (jeweils Mittelwerte ± Standardabweichungen; drei Re- plikate). Der Unterschied zwischen beiden war statistisch signifikant (p ≤ 0,01, Wilco- xon-Mann-Whitney-Rangsummentest).

2 Die Zellregeneration der Darmepithelzellen lief unter Normalbedingungen ohne oxidati- ven Stress innerhalb von 12 Stunden so ab, dass nach dieser Zeit noch 32,8 ± 5,4 % der Gesamtfläche nicht besiedelt war (Abb. 1A). Die zusätzliche Befeldung unter die- sen Bedingungen für 3 x 20 Minuten mit der Handsonde des TESLA Oszillators ergab eine Stimulation mit einem Wert für die unbesiedelte Gesamtfläche von 20,5 ± 4,8 % (Abb. 1B) und unterschied sich damit signifikant vom Wert ohne Befeldung (p ≤ 0,05, Wilcoxon-Mann-Whitney-Rangsummentest). Der Verlauf der Zellregeneration bei gleichzeitigem oxidativem Stress durch 1 mM Wasserstoffperoxid im Kulturmedium verlief in allen Versuchen langsamer. Hier betrug der verbliebene zellfreie Raum ohne Befeldung 46,1 ± 5,5 % (Abb. 1C) und durch die Protektion bei Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators nur 31,2 ± 3,3 % (Abb. 1D). Somit wurde zwar die Wirkung des oxidativen Stress durch Wasserstoff- peroxid bei der Zellregeneration nicht vollständig kompensiert, aber statistisch signifi- kant gegenüber der unbefeldeten Kontrolle verbessert (p ≤ 0,01; Wilcoxon-Mann-Whit- ney-Rangsummentest). Alle Zahlenangaben sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus drei Replikaten.

3 Die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) als Maß für die Integrität der Darmwandbarriere auf Transwell-Kulturschaleneinsätzen nach 6-tägiger Inkubation ohne und mit Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators für 3 x

C D

Abb. 1: Regeneration der kultivierten Lungenzellen ohne (A, B) und bei gleichzeitigem oxidati- vem Stress (C, D) ohne (A, C) und mit (B, D) 3 x 20 Minuten Befeldung in 12 Stunden durch die Handsonde des TESLA Oszillators. Nähere Erläuterungen im Text.

20 Minuten pro Tag betrug 3.123 ± 201 Ω/cm2 und für die unbefeldeten Kontrollzellen betrug er 2.561 ± 187 Ω/cm2 (jeweils Mittelwert ± Standardabweichung). Im direkten Vergleich wurde durch die Befeldung mit dem Tesla Experimentierset der TEER um etwa 22 % im Vergleich zur unbefeldeten Kontrolle verbessert. Diese Verbesserung der Integrität der Darmwandbarriere durch die Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators war statistisch signifikant (p ≤ 0.05; Wilcoxon-Mann-Whitney-Rang- summentest). Alle Zahlenangaben sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei Replikaten).

4 Danach wurde die Zellschicht der Darmwandbarriere Konzentrationen von 0,5 mM und 1 mM Wasserstoffperoxid für weitere 12 Stunden ausgesetzt. In dieser Zeit wurden die in der Vorinkubation bereits befeldeten Zellen nochmals für 3 x 20 Minuten weiter be- feldet. Eine Quantifizierung der Messung ergab einen TEER von 199 ± 10,3 Ω/cm2 für die Kontrollzellen und einen TEER von 277 ± 8,5 Ω/cm2 für die befeldeten Zellen (Mit- telwerte ± Standardabweichungen aus zwei Replikaten). Daraus ergibt sich für die be-

Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 feldeten Zellschichten ein um 39,2 % besserer Erhalt der Darmwandbarriere auch un- ter den Bedingungen des oxidativen Stress. Berücksichtigt man hierbei die Tatsache, dass die Integrität der Darmwandbarriere vor dem oxidativen Stress um etwa 22 % besser war als bei den Kontrollzellen, so hatte die Befeldung bei oxidativem Stress ei- nen protektiven Effekt von 39,2 % – 22 % = 17,2 %.

Versuchsleiter und verantwortlich für die durchgeführten Untersuchungen und den Inhalt des Testberichtes.

Prof. Dr. Peter C. Dartsch Diplom-Biochemiker