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Testbericht oxidativer Stress bei Lungenzellen_03.06.2023

Dartsch Scientific GmbH  Auf der Voßhardt 25  D-49419 Wagenfeld Auf der Voßhardt 25 Wassermatrix AG D-49419 Wagenfeld, Germany Blegistrasse 1 Fon: +49 5444 980 1322 Mobil: +49 151 2272 1294 CH- 6343 Rotkreuz Email: info@dartsch-scientific.com Web: www.dartsch-scientific.com

Juni 2023

TESTBERICHT Wirkeffekte des TESLA Oszillators bei exogenem oxidativem Stress

Untersuchungen mit kultivierten Lungenzellen des Menschen

Hintergrund und Fragestellung Das Tesla Experimentier-Set der Firma Wassermatrix AG aus CH-6343 Rotkreuz in der Schweiz wird so beschrieben, dass es über die Handsonde (1) Wasser in einem Glas infor- mieren/strukturieren/energetisieren kann, so dass nach dem Trinken die körpereigenen Energiefelder aktiviert und die Selbstheilungskräfte angesprochen werden und (2) auch direkt das Körperwasser energetisieren kann. In der vorliegenden Studie wurde mit tierver- suchsfreien und aktuellen zellbiologischen Testverfahren untersucht, ob das Tesla Experi- mentier-Set in der Lage ist, einen möglichen Radikalüberschuss aus der Umwelt bzw. Um- gebung zu kompensieren und so einen unerwünschten oxidativen Stress zu vermindern. Als Zellkulturmodell wurden kultivierte Lungenzellen des Menschen gewählt, welches als offenes System direkt in Kontakt mit der Umwelt stehen und somit der Primärwirkung von Umweltverschmutzung durch mikrobielle Pathogene, Feinststaub, chemischen Substan- zen etc. ausgesetzt ist, welche zu einem oxidativen Stress führen können.

Verwendete Zellen Es wurden Lungenzellen des Menschen (Zelllinie A-549) verwendet. Dies ist eine spezifi- zierte, humane Zelllinie, die in der Zellbiologie, Molekularbiologie, Virologie und Pharmako- logie in der präklinischen Forschung verwendet wird. Sie stammt von einem explantierten Adenokarzinom aus der Lunge eines 58-jährigen Mannes. Die Zellen wurden routinemäßig als Massenkulturen in DMEM/Ham’s F12 Kulturmedium (1:1) mit 10 % Wachstumsge- misch und Penicillin/Streptomycin in einem Begasungsbrutschrank bei 37 °C und einer At- mosphäre aus 5 % CO2 und 95 % Luft sowie nahezu 100 % Luftfeuchtigkeit kultiviert und in standardisierten Zelldichten in die Versuche eingesetzt.

Versuchsaufbau Für die Befeldung wurde die Handsonde außerhalb des Brutschrankes senkrecht mit dem grünen Antennenstab nach unten in ein Tischstativ eingespannt. Die zu behandelnden Zellkulturen wurden direkt unter die Spitze des Antennenstabs plaziert. Die entsprechen- Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 den Kontrollen befanden sich für die gleiche Zeit in einem anderen Raum mindestens 5 m entfernt hinter mehreren Wänden. Die Exposition erfolgte bei Raumtemperatur innerhalb von 24 Stunden für jeweils 3 x 20 Minuten in mehrstündigem Abstand. Bei Experimenten mit einer Vorinkubation der Zellen wurde an jedem Tag für 3 x 20 Minuten befeldet.

Durchgeführte Versuche Grundsätzlich wurde für die Untersuchungen als standardisierter oxidativer Stress in der Umgebung der Zellen Wasserstoffperoxid zur Bereitstellung von reaktiven Sauerstoff- spezies (ROS) im Konzentrationsbereich zwischen 0,25 und 1 mM im Kulturmedium ver- wendet. Als entsprechende Kontrollen dienten parallel angesetzte Zellkulturen ohne Befel- dung. Es wurden die folgenden Tests in Form von mehreren Replikaten pro Wasserstoff- peroxid-Konzentration durchgeführt: 1 Überlebensfähigkeit der Zellen innerhalb von 24 Stunden bei Einwirkung von exoge- nem oxidativen Stress mit und ohne Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszil- lators 2 Zellregeneration bei der gleichzeitigen Einwirkung von exogenem oxidativen Stress mit und ohne Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators 3 Integrität der pulmonalen Lungenepithelzellschicht nach Einwirkung von exogenem oxi- dativen Stress mit und ohne Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators

Ergebnisse 1 Im direkten Vergleich der Überlebensfähigkeit der Lungenzellen innerhalb von 24 Stun- den bei Einwirkung von exogenem oxidativen Stress war deutlich feststellbar, dass die mit der Handsonde befeldeten Zellen signifikant (p ≤ 0,05; Wilcoxon-Mann-Whitney- Rangsummentest) höhere Vitalitätswerte hatten als die unbehandelten Kontrollen (Abb. 1). Dies war bei allen Wasserstoffperoxid-Konzentrationen feststellbar. 110 Abb. 1: Graphische Darstel- lung der Zellvitalität in Abhän- 100 gigkeit von der Wasserstoff- peroxid-Konzentration. Es ist Zellvitalität in %

90 deutlich erkennbar, dass die befeldeten Zellen (grüne Säu- len) bei allen Konzentrationen 80 eine signifikant bessere Über- lebensfähigkeit der Lungen- 70 zellen aufweisen als die unbe- handelten Kontrollen (gelbe 60 Säulen). Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabwei- chung aus jeweils vier Repli- 50 katen. 0,25 1 0,5 2 13 Wasserstoffperoxid-Konzentration in mM

Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 2 Die Zellregeneration der Lungenzellen lief unter Normalbedingungen ohne oxidativen Stress innerhalb von 24 Stunden so ab, dass nach dieser Zeit noch 29,3 ± 4,1 % der Gesamtfläche nicht besiedelt war. Die zusätzliche Befeldung unter diesen Bedingun- gen für 3 x 20 Minuten mit der Handsonde des TESLA Oszillators ergab einen Wert von 28,6 ± 6,5 % und unterschied sich damit nicht vom Wert ohne Befeldung. Ganz anders der Verlauf der Zellregeneration bei gleichzeitigem oxidativem Stress mit 0,5 mM Wasserstoffperoxid im Kulturmedium. Hier betrug der verbliebene zellfreie Raum ohne Befeldung noch 56,7 ± 7,3 % und bei Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators nur 39,8 ± 3,7 %. Dieser Effekt ist sehr gut in den Mikrofotografien zu sehen (Abb. 2). Somit wurde zwar die Wirkung des oxidativen Stress durch Wasser- stoffperoxid bei der Zellregeneration nicht vollständig kompensiert, aber statistisch sig- nifikant gegenüber der unbefeldeten Kontrolle verbessert (p ≤ 0,01; Wilcoxon-Mann- Whitney-Rangsummentest). Alle Zahlenangaben sind Mittelwerte ± Standardabwei- chungen aus drei Replikaten.

Abb. 2: Regeneration der kultivierten Lungenzellen bei oxidativem Stress ohne und mit Befel- dung durch die Handsonde des TESLA Oszillators. Es ist sehr gut erkennbar, dass der zellfreie Raum nach 24 Stunden im Falle der Befeldung deutlich geringer ist als ohne Befeldung.

3 Die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) als Maß für die Integrität der pulmonalen Lungenepithelzellschicht auf Transwell-Kulturschaleneinsät- zen nach 4-tägiger Inkubation ohne und mit Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszillators für 3 x 20 Minuten pro Tag ergab keinen Unterschied zwischen den befelde- ten Zellkulturen und den entsprechenden Kontrollen. Danach wurden die Zellschichten Konzentrationen von 0,5 mM und 1 mM Wasserstoff- peroxid für weitere 24 Stunden ausgesetzt. In dieser Zeit wurden die in der Vorinkuba- tion bereits befeldeten Zellen nochmals für 3 x 20 Minuten weiter befeldet. Eine Quanti- fizierung der Messung war nicht möglich, so dass an Hand von morphologischen Krite- rien (Abb. 3) ausgewertet werden musste. Es zeigte sich, dass die Integrität der Epi- thelzellschicht im Falle der mehrtägigen Befeldung deutlich besser war als ohne Befel-

Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 dung. Daraus ist zu schließen, dass die Befeldung mit der Handsonde des TESLA Os- zillators einen protektiven Effekt bei exogenem oxidativem Stress bewirkte.

Zellen ohne Befeldung Zellen mit Befeldung

Abb. 3: Integrität der Lungenepithelzellschicht nach der 24-stündigen Einwirkung von 0,5 mM Wasserstoffperoxid bei Zellen ohne und mit Befeldung mit der Handsonde des TESLA Oszilla- tors.

Zusätzlich zu den hier dargestellten Untersuchungen wurde das unterschiedliche Ausmaß der morphologischen Veränderungen in Massenkulturen bis hin zum Absterben der Lun- genzellen ohne und mit dem Schutz durch die 3 x 20 Minuten Befeldung mit der Handson- de des TESLA Oszillators pro Tag in dynamischer Form in Zeitraffer-Videos dokumentiert.

Versuchsleiter und verantwortlich für die durchgeführten Untersuchungen und den Inhalt des Testberichtes.

Prof. Dr. Peter C. Dartsch Diplom-Biochemiker