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Testbericht oxidativer Stress & Darmwand_23.11.2022

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Dartsch Scientific GmbH  Auf der Voßhardt 25  D-49419 Wagenfeld Auf der Voßhardt 25 D-49419 Wagenfeld, Germany Wassermatrix AG Blegistrasse 1 Fon: +49 5444 980 1322 Mobil: +49 151 2272 1294 CH- 6343 Rotkreuz, Schweiz Email: info@dartsch-scientific.com Web: www.dartsch-scientific.com

November 2022

TESTBERICHT Protektive Effekte des Tesla Experimentiersets bei Einwirkung von oxidativem Stress auf kultivierte Darmepithelzellen

1 Hintergrund und Fragestellung Das Tesla Experimentier-Set der Firma Wassermatrix AG aus CH-6343 Rotkreuz in der Schweiz wird auf der Homepage (www.wassermatrix.ch) so beschrieben, dass es über die Handsonde Wasser informieren bzw. strukturieren oder energetisieren kann. Das solcher- maßen energetisiertes Wasser wird dann durch Trinken dem Körper zugeführt. Dadurch werden die körpereigenen Energiefelder aktiviert und die Selbstheilungskräfte werden an- gesprochen. In diesem Zusammenhang ist zu berücksichtigen, dass der Mensch – in Abhängigkeit vom Lebensalter – zu mindestens 70 % aus Wasser besteht, so dass auch die Möglichkeit zur direkten Energetisierung des Körperwassers möglich ist. Lt. Hersteller “berichten viele Nutzer von erstaunlichen Verbesserungen bei Vitalität, Gesundheit und Wohlbefinden”. In der vorliegenden Studie wurde mit aktuellen zellbiologischen Testverfahren bei kultivier- ten Darmepithelzellen untersucht, ob das Tesla Experimentierset bei einem Überangebot von Sauerstoffradikalen einem oxidativen Stress im Darm vorbeugen oder diesen vermin- dern kann und so die Integrität der Darmwandbarriere gewährleistet wird. Ein solcher oxi- dativer Stress kann neben einem gesundheitlichen Missbehagen/Unwohlbefinden auch zu einem Reiz- und/oder durchlässigen Darm (leaky gut) oder sogar zu chronisch-entzündli- chen Prozessen führen.

2 Versuchsaufbau Die Handsonde wurde außerhalb des Brutschrankes senkrecht mit dem grünen Antennen- stab nach unten in ein Tischstativ eingespannt. Die zu energetisierenden Zellkulturen wur- den direkt unter dem Antennenstab plaziert und so mit der Handsonde befeldet. Die Befel- dungszeiten werden im Testbericht gesondert bei den einzelnen Versuchen aufgeführt. Die entsprechenden Kontrollen befanden sich für die Zeit der Befeldung in einem anderen Raumbereich etwa 10 m entfernt und hinter mehreren Wänden. Die Befeldung der Darm- epithelzellen erfolgte bei Raumtemperatur.

Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 Seite 2 von 6

3 Verwendete Darmepithelzellen und Zellkultivierung Die hier durchgeführten Untersuchungen wurden mit IPEC-J2-Zellen (ACC-701; Leibniz Institut, DSMZ, Braunschweig, Deutschland) durchgeführt. Die Zellen wurden routinemä- ßig in Dulbecco's Modifikation von Eagles Medium und Ham’s F 12 (1:1; DMEM mit 1,0 g/l Glucose) mit 10 % Wachstumsgemisch und 1 % Penicillin/Streptomycin in einem Bega- sungsbrutschrank bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 5 % CO2 und 95 % Luft bei nahezu 100 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Zellen wurden routinemäßig als Massenkulturen ge- züchtet und regelmäßig zweimal wöchentlich mit frischem Kulturmedium subkultiviert. Für die Experimente wurden Zellen aus 80 bis 90 % konfluenten Massenkulturen genommen. Laut Vergauwen (2015) sind IPEC-J2-Zellen „intestinale Schweine-Enterozyten, die aus dem Jejunum eines neugeborenen ungesäugten Ferkels isoliert wurden. Die IPEC-J2-Zell- linie ist einzigartig, da sie aus dem Dünndarm stammt und von Natur aus weder transfor- miert noch tumorerzeugend ist. IPEC-J2-Zellen ahmen die menschliche Physiologie bes- ser nach als jede andere Zelllinie nicht-menschlichen Ursprungs.“ Der Vorteil der IPEC-J2-Zelllinie als in vitro-Modell ergibt sich aus ihrer morphologischen und funktionellen Ähnlichkeit mit intestinalen Epithelzellen in vivo. IPEC-J2-Zellen haben bei entsprechender Kultivierung Mikrovilli auf ihrer apikalen Seite sowie sog. tight junctions als Zellkontakte zwischen den einzelnen Zellen einer konfluenten Zellschicht, die als selek- tive Darmwandbarriere wirken und die epitheliale Funktionalität widerspiegeln (Schierack et al. 2006). In Epithelien verhindert diese Abdichtung des Interzellularraumes durch tight junctions das unerwünschte Eindringen von Molekülen und Ionen durch das Epithel und auch gleichzeitig den Ausstrom von Körperflüssigkeiten (z.B. Blut). Vergauwen H (2015). The IPEC-J2 cell line. In: Verhoeckx K. et al. (eds) The Impact of Food Bio- actives on Health. Springer, Cham, pp. 125-134. https://doi.org/10.1007/978-3-319-16104-4_12. Schierack P, Nordhoff M, Pollmann M, Weyrauch KD, Amasheh S, Lodemann U, Jores J, Tachu B, Kleta S, Blikslager A, Tedin K, Wieler LH (2006). Characterization of a porcine intestinal epi- thelial cell line for in vitro studies of microbial pathogenesis in swine. Histochem Cell Biol 125:293–305. doi: 10.1007/s00418-005-0067-z

4 Überlebensfähigkeit der Darmepithelzellen bei oxidativem Stress Die Darmepithelzellen wurden in einer Dichte von 25.000 Zellen/Vertiefung in 96-Loch-Kul- turplatten ausgesät. Nach 48 Stunden, welche die Zellen zum Absetzen, Ausbreiten und Wiederaufnahme des Stoffwechsels brauchen, wurde das Kulturmedium gewechselt und Wasserstoffperoxid-Testkonzentrationen von 0 (= interne Kontrolle) bis 4.000 µM zugege- ben. Eine Kulturschale pro Versuchsansatz wurde innerhalb von 24 Stunden insgesamt viermal für 2 x 10 Minuten mit dem Tesla-Experimentierset befeldet. Die unbefeldete Kon- trolle wurde bei allen Befeldungen die gleiche Zeit im Raumbereich außerhalb des Brut- schrankes aufbewahrt. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensfähigkeit der Zellen durch eine enzymatische Bestimmung der mitochondrialen Dehydrogenase-Aktivität bestimmt. Dazu wurden die Kulturplatten mehrmals zum Entfernen des Wasserstoffperoxids gewa- schen und frisches Kulturmedium mit XTT (= Natrium-3’-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tet- razolium]-bis (4-methoxy-6-nitro)benzolsulfonsäurehydrat; Xenometrix, Allschwil, Schweiz) Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 Seite 3 von 6

zugegeben. XTT ist ein Tetrazoliumsalz mit schwach gelber Farbe. Durch die Stoffwech- selaktivität der Zellen wird der Farbstoff gespalten und es entsteht ein orangefarbenes und wasserlösliches Formazan. Die Intensität der entstehenden Farbe der Reaktionslösung nimmt mit der Enzymaktivität zu und wird photometrisch bestimmt (Scudiero et al. 1988). Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde nach 0 min und nach 140 min bei 37 °C als Dif- ferenzmessung bei ΔOD = 450 nm – 690 nm am Elisareader (BioTek ELx808 mit Software Gen 5 Version 3.00) gemessen, mit Microsoft Excel ausgewertet und mit dem zweiseitigen parameterfreien Wilcoxon-Mann-Whitney-Rangsummentest statistisch analysiert. Scudiero DA et al. (1988). Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res 48: 4827-4833.

Ergebnis Die Auswertung zeigte, dass bei Wasserstoffperoxid-Konzentrationen ≥ 1.500 µM die Überlebensfähigkeit der Zellen stets unter 5 % lag. Das galt auch für die befeldeten Zellen. Ganz anders sah es bei niedrigeren Konzentrationen ≤ 500 µM aus. In diesem Konzentra- tionsbereich kam es zu keinerlei Reduktion der Überlebensfähigkeit der Zellen. Genau in diesem engen Konzentrationsfenster, nämlich bei 1.000 µM betrug die Überlebensfähigkeit der unbefeldeten Kontrollzellen 24,19 ± 10,75 %. Die Überlebensfähigkeit der mit dem Tesla Experimentierset befeldeten Zellen war dagegen fast doppelt so hoch und betrug 45,32 ± 8,20 % (jeweils Mittelwerte ± Standardabweichungen; n = 2 in Duplikaten). Der Unterschied zwischen beiden war statistisch signifikant (p ≤ 0,05).

5 Zellregeneration bei oxidativem Stress Der Verlauf von Zellregenerations- bzw. Wundheilungsprozessen kann in vivo in verschie- dene Phasen eingeteilt werden. Eine der gängigsten Beschreibungen unterteilt die Wund- heilung in vier Phasen: Entzündungsphase, Resorptionsphase, Proliferations- oder Granu- lationsphase und Remodellierungsphase. In dieser Studie wurde die Granulationsphase si- muliert, die durch das Auftreten von Migration und Proliferation von Epithelzellen zum Schließen eines Defekts mit zellfreien Arealen in einer sonst intakten Zellschicht gekenn- zeichnet ist. Die Darmepithelzellen wurden in einer Dichte von 100.000 Zellen/ml in die 4 einzelnen Kompartimente eines Kultureinsatzes aus Silikon (ibidi, Gräfelfing, Deutschland) ausgesät. Die einzelnen Kompartimente der Einsätze sind durch einen 500 μm dicken Silikonsteg voneinander getrennt und haben einen äußeren Silikonrahmen von 700 μm. Durch die spezielle Haftfläche haftet ein Einsatz fest auf dem Boden einer Kulturschale und bildet nach der Zellaussaat einen definierten zellfreien Bereich (künstliche Wunde), den die Zel- len nach dem Entfernen des Silikoneinsatzes durch Migration und Proliferation besiedeln können. 48 Stunden nach der Zellaussaat wurden die Silikonrahmen mit einer Pinzette entfernt und 0 µM (= interne Lösemittelkontrolle) sowie 1.000 µM Wasserstoffperoxid zum Kulturmedium zugegeben. Einen Tag vor der Entfernung des Silikonrahmens und direkt danach wurden die Zellen mit der Handsonde für jeweils 2 x 10 Minuten befeldet; die Kon-

trollkulturen mit den gleichen Konzentrationen an Wasserstoffperoxid blieben ohne Befel- dung. Die Zellen konnten danach in den zellfreien Raum einwandern und dort proliferieren. Der besiedelte Bereich wurde durch Mikroaufnahmen dokumentiert und durch eine spezia- lisierte Software mit künstlicher Intelligenz von KML Vision, Graz, Österreich (IKOSA AI Software) berechnet. Es wurden drei unabhängige Versuchsreihen (n = 3) durchgeführt. Die statistische Analyse erfolgte mit dem zweiseitigen parameterfreien Wilcoxon-Mann- Whitney-Rangsummentest.

Ergebnis Die morphologische Auswertung der Zellregeneration ohne oxidativen Stress durch die Zu- gabe von Wasserstoffperoxid zeigte eine Verbesserung der Besiedlung des zellfreien Rau- mes durch die zweimalige Befeldung mit dem Tesla Experimentierset (Abb. 1A,C). So be- trug der verbleibende zellfreie Raum für die unbefeldeten Kulturen 28,65 ± 5,74 % der Ge- samtfläche, aber nur noch 13,98 ± 4,23 % der Gesamtfläche für die befeldeten Kulturen (jeweils Mittelwert ± Standardabweichung). Der Unterschied war statistisch signifikant (p ≤ 0,05). Bei den Zellkulturen welche ohne und mit Befeldung durch das Tesla Experimentier- set einem gleichzeitigen oxidativen Stress durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid aus- gesetzt wurden, war der Unterschied noch deutlicher – auch wenn der regenerative Pro- zess so grundsätzlich deutlich verlangsamt wurde (Abb. 1B,D). Hier betrug der verbleiben- de zellfreie Raum für die unbefeldeten Kulturen 52,49 ± 9,31 % der Gesamtfläche und für die befeldeten Kulturen 36,70 ± 6,77 % der Gesamtfläche (jeweils Mittelwert ± Standardab- weichung). Der Unterschied war ebenfalls statistisch signifikant (p ≤ 0,05).

Abb. 1: Regeneration der Darmepithelzellen ohne (A,C) und mit (B,D) oxidativem Stress durch die Zugabe von 1.000 µM Wasserstoffperoxid nach 21 Stunden. Die unbefeldeten Kontrollzellen sind jeweils oben abgebildet (A,B) und die mit dem Tesla Experimentierset zweifach befeldeten Zellen sind jeweils unten abgebildet (C,D). Dartsch Scientific GmbH Geschäftsführer: Amtsgericht Walsrode HRB 206302 Auf der Voßhardt 25 Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Steuer-Nr. 45/202/10932 D-49419 Wagenfeld, Germany Diplom-Biochemiker USt-IdNr. DE 222586342 Seite 5 von 6

6 Integrität der Darmwandbarriere und transepithelialer Widerstand (TEER) Das einschichtige Darmepithel hat mehrere wichtige Aufgaben, nämlich eine physikalische Barriere zwischen dem Inhalt des Darmlumens und dem Rest unseres Körpers zu schaf- fen sowie eine effiziente Aufnahme essentieller Nährstoffe aus dem Darmlumen sicher zu stellen und Schleim und Substanzen mit immunregulatorischen Eigenschaften zu produ- zieren. Somit kann eine verminderte Barrierefunktion weitreichende Folgen nicht nur allein für die Darmgesundheit, sondern auch für die systemische Gesundheit haben, da Fremd- keime oder unerwünschte Nahrungsbestandteile ins Blut gelangen können. Die Bestimmung des transepithelialen Widerstandes (TEER) ist eine experimentelle Me- thode, welche Informationen über die Gleichmäßigkeit der Darmepithelzellschicht auf der mikroporösen Filtermembran und über die Integrität der zwischen den polarisierten Zellen gebildeten tight junctions liefert (Geens und Niewold 2011). Die IPEC-J2-Zellen wurden 7 Tage lang auf der Oberfläche einer 0,4 µm porösen Memb- ran (Transwell-Platte, Corning, Sigma-Aldrich, Deisenhofen) gezüchtet, so dass sich zwei getrennte Kompartimente (oberes Kompartiment = Darmlumen; unteres Kompartiment = Blut) innerhalb der Zellkulturschale ergaben. Die Zellschicht, die die Oberfläche der Memb- ran bedeckt, stellt eine physikalische Barriere gegenüber dem unteren Kompartiment dar. Die Befeldung fand an den letzten vier Tagen der Kultivierung zweimal täglich für jeweils 2 x 10 Minuten bei Raumtemperatur statt. Die nicht befeldeten Kontrollzellen wurden im gleichen Raum platziert wie im Versuchsaufbau beschrieben. Der TEER wurde gemessen, indem eine Elektrode in das Kulturmedium der oberen Kammer und eine Elektrode in das Kulturmedium in der unteren Kammer gehalten wurde. Der Widerstand wurde direkt mit ei- nem tragbaren Voltmeter (Millicell ERS-2 Voltmeter, Millipore/Merck, Darmstadt) gemes- sen. Erst Darmepithelzellschichten mit einem elektrischen Widerstand von mindestens 2.000 Ω/cm2 entsprechen lt. der wissenschaftlichen Literatur einer intakten physikalischen Barriere mit sehr guter Integrität (Tilvescu et al. 2019; Kovanda et al. 2020). Der TEER der porösen Membran ohne Zellbarriere wurde mit Werten von 160 Ω/cm2 gemessen. Es wurden drei unabhängige Versuche (n = 3) durchgeführt. Die statistische Analyse der Versuchsergebnisse wurde mit dem parameterfreien zweiseitigen Wilcoxon-Mann-Whit- ney-Test vorgenommen. Geens MM, Niewold TA (2011). Optimizing culture conditions of a porcine epithelial cell line IPEC- J2 through a histological and physiological characterization. Cytotechnology 63: 415-423. Tîlvescu O, Tîlvescu I, Mărgău d, Cărpinișan L, Ghișe A (2019). Monitoring the intestinal barrier function using TEER measurement technique. Medicina Veterinara 52: 117-122. Kovanda LL, Hejna M, Liu Y (2020). Butyric acid and derivatives: In vitro effects on barrier integrity of porcine intestinal epithelial cells quantified by transepithelial electrical resistance. J Anim Sci 98: Suppl. S4: 109.

Ergebnis Durch die beschriebene mehrmalige Befeldung mit der Handsonde des Tesla Experimen- tiersets wurde der TEER – und damit die Integrität der Darmwandbarriere – nach 7 Tagen mit 3.795 ± 247 Ω/cm2 bestimmt und für die unbefeldeten Kontrollzellen betrug der TEER

2.704 ± 334 Ω/cm2 (jeweils Mittelwert ± Standardabweichung). Im direkten Vergleich wur- de durch die Befeldung mit dem Tesla Experimentierset der TEER um nahezu 40 % im Vergleich zur unbefeldeten Kontrolle verbessert und somit eine statistisch signifikante Ver- besserung der Integrität der Darmwandbarriere durch die Befeldung erzielt (p ≤ 0.01).

7 Integrität der Darmwandbarriere bei oxidativem Stress Eine solchermaßen verbesserte Integrität der Darmwandbarriere könnte möglicherweise auch besser einem oxidativen Stress widerstehen. Daher wurde die Darmwandbarriere mit und ohne Befeldung für weitere 12 Stunden 1.000 µM Wasserstoffperoxid ausgesetzt und danach der TEER erneut gemessen.

Ergebnis Tatsächlich zeigte die durch die Befeldung mit dem Tesla-Experimentierset verbesserte In- tegrität der Darmwandbarriere auch bei oxidativem Stress mit einem resultierenden TEER von 177 ± 4,2 Ω/cm2 einen ebenfalls höheren TEER-Wert als die unbefeldete Kontrolle mit 163,5 ± 4,9 Ω/cm2 (jeweils Mittelwert ± Standardabweichung). Daraus ergibt sich für die befeldeten Zellschichten ein um annähernd 9 % besserer Erhalt der Darmwandbarriere auch unter diesen Bedingungen des oxidativen Stress. Dennoch zeigt die Versuchsserie, dass durch das Wasserstoffperoxid die Integrität der Darmwandbarriere grundsätzlich er- heblich vermindert wurde.

8 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen In den hier durchgeführten tierversuchsfreien Untersuchungen mit kultivierten Darmepithel- zellen hat die Befeldung mit dem Tesla Experimentierset der Firma Wassermatrix AG sei- ne förderlichen Eigenschaften auf Zellebene deutlich zeigen können. In den durchgeführ- ten Untersuchungen war die mehrmalige Befeldung in der Lage, ein Überangebot von Sauerstoffradikalen im Darm zu vermindern und so einem unerwünschten oxidativen Stress vorzubeugen. Zudem wurde die Integrität der Darmwandbarriere sowie ihr regene- ratives Potenzial und auch ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber Sauerstoffradikalen durch die Befeldung mit dem Tesla Experimentierset statistisch signifikant verbessert. Dies kann im Gesamtorganismus zu einer Steigerung der Darmgesundheit und damit auch des allge- meinen Wohlbefindens führen.

Prof. Dr. Peter C. Dartsch Diplom-Biochemiker